在线观看国产日韩欧美I最近中文字幕完整高清I免费看成年人I国产免费观看高清完整版I99国内精品I日韩色av色资源

精制抗體的方法很多。一般采用綜合技術，避免蛋白變性。如分離IgG時，多結合使用鹽析法與離子交換法，以求純化。提取IgM的方法也很多，如應用凝膠過濾與制備電泳法，或離子交換與凝膠過濾等。

一、原理

蛋白質在水溶液中的溶解度是由蛋白質周圍親水基團與水形成水化膜的程度，以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。當用中性鹽加入蛋白質溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質，于是蛋白質分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質溶液后，由于離子強度發生改變，蛋白質表面電荷大量被中和，更加導致蛋白溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。

1、試劑

（1）正常人混合血清；滅菌生理鹽水。

（2）飽和硫酸銨溶液的配制

稱（NH4）₂SO₄（AR）400～425克，以50～80℃之蒸餾水500ml溶解，攪拌20分鐘，趁熱過濾。冷卻后以濃氨水（15N　NH₄OH）調PH至7.4。配制好的飽和硫酸銨，瓶底應有結晶析出。

（3）萘氏試劑配制

稱HgI 11.5克，KI8克，加蒸餾水至50ml，攪拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。

（4）0.02M，PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制：

貯存液

A液：0.2M Na₂HPO₄：Na₂HPO₄·12H₂O 71.64克，加蒸餾水至1000ml；

B液： 0.2M NaH₂P₄：NaH₂P₄·2H₂O 3.12克，加蒸餾水至1000ml；

應用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理鹽水作10倍稀釋即成。

（5）0.1M，PH7.4磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer P配制

將上述A液取81ml與B液19ml混合，再以蒸餾水對倍稀釋即成。

（6）20%磺基水楊酸。

2、器材

普通冰箱、離心機、電磁攪拌器，751桮型紫外分光光度計、扭力天平，粗天平。透析袋、尼龍繩、細竹棒、精密PH試紙（PH5.5～9.0）、眼科鑷子、小剪刀。燒杯、量筒、吸管、滴管、滅菌小瓶、試管等。

3、實驗操作

取1X ml血清加1X ml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2X ml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。

↓4℃，3h以上，使其充分沉淀　　

離心（3000rpm），20min，充上清，以x ml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。

↓置4℃3h以上，[此時，（nh4）2so4的飽和度為33%]

重復上述第二步過程1～2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白，以0.02% mol/l pH7.4pbs溶解至x ml裝入透析袋。

↓對PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測透析外液無黃色，即無NH4+為止。

取透析袋內樣品少許作適當倍數稀釋后，以752型紫外分光光度計測定蛋白含量。

4、影響鹽析的因素

影響鹽析的因素很多，如蛋白質的濃度，鹽的濃度，飽和度和pH，溫度等都可影響鹽析的結果，操作時要充分注意。

（1）蛋白質的濃度

鹽析時，溶液中蛋白質的濃度對沉淀有雙重影響，既可影響蛋白質沉淀極限，又可影響蛋白質的共沉作用。蛋白質濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低，但雜蛋白的共沉作用也隨之增加，從而影響蛋白質的純化。故常將血清以生理鹽水作對倍稀釋后再鹽析。

（2）離子強度

各種蛋白質的沉淀要求不同的離子強度。例如當硫酸銨飽和度不同，析出的成分就不同，飽和度為50％時，少量白蛋白及大多數擬球蛋白析出；飽和度為33％時γ球蛋白析出。

（3）鹽的性質

有效的鹽是多電荷陰離子。

（4）PH值

一般說來，蛋白質所帶凈電荷越多，它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質的帶電性質，也就改變了蛋白質的溶解度。

（5）溫度

鹽析時溫度要求并不嚴格，一般可在室溫下操作。血清蛋白于25℃時較0℃更易析出。但對溫度敏感的蛋白質，則應于低溫下鹽析。

（6）蛋白質沉淀后宜在4℃放3小時以上或過夜，以形成較大沉淀而易于分離。