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近年來(lái)，分子診斷領(lǐng)域的發(fā)展遇到的契機(jī)，加之相關(guān)政策的制定與傾斜，更使其蓬勃發(fā)展。分子診斷以其快速、靈敏、的特點(diǎn)在疾病發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等各個(gè)階段均可發(fā)揮一定的作用而使其在醫(yī)療行業(yè)中得到了較廣泛的認(rèn)可。
一
分子診斷及分子診斷自動(dòng)化概述
分子診斷是應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法獲得人體生物大分子及其體系存在結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化水平，為疾病的防治、預(yù)測(cè)、診斷、治療和預(yù)后判斷提供信息和決策依據(jù)的新興的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分支學(xué)科[1，2，3]。
自20世紀(jì)70年代起，分子診斷領(lǐng)域的研究異軍突起、方興未艾，迅速成為體外診斷重要的領(lǐng)域之一，是體外診斷領(lǐng)域中技術(shù)要求高、發(fā)展快、富有挑戰(zhàn)性的一個(gè)分支[4]。分子診斷的發(fā)展史可分四大階段：1978年，簡(jiǎn)悅威等應(yīng)用液相DNA分子雜交成功地進(jìn)行了鐮形細(xì)胞貧血癥基因診斷，標(biāo)志著分子診斷的誕生；到1985年，Kary Mullis博士發(fā)明PCR技術(shù)，標(biāo)志著分子診斷進(jìn)入了第二階段；1992年，美國(guó)Affymetrix公司制造出張基因芯片，標(biāo)志著分子診斷進(jìn)入生物芯片階段；2005年，454 Life sciences公司推出基于焦磷酸測(cè)序法的測(cè)序系統(tǒng)，開(kāi)創(chuàng)了第二代測(cè)序技術(shù)的先河，分子診斷進(jìn)入檢測(cè)的高通量時(shí)代，應(yīng)用范圍進(jìn)一步擴(kuò)展。
國(guó)內(nèi)分子診斷技術(shù)的發(fā)展歷史依然遵循著世界分子診斷發(fā)展的大方向，大致分為以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的萌芽階段，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的發(fā)展階段，以及以高通量測(cè)序、微滴式數(shù)字PCR和液體活檢等技術(shù)為基礎(chǔ)的黃金時(shí)代三個(gè)階段[5]。常規(guī)體液標(biāo)本逐漸被賦予新的內(nèi)容，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumorcell，CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumor DNA，ctDNA)、外泌體(exosome)等遺傳信息載體的發(fā)展日新月異，令人充滿無(wú)盡的遐想[6]。
分子診斷自動(dòng)化即全自動(dòng)化集成式的分子診斷系統(tǒng)，主要包括樣本采集、樣品處理(細(xì)胞濃縮、細(xì)胞破碎)、核酸提取(DNA/RNA分離等)、基因擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)(實(shí)時(shí)熒光定量、核酸雜交等)等檢測(cè)過(guò)程。由于分子診斷中樣本預(yù)處理過(guò)程復(fù)雜，常需的溫控系統(tǒng)，手工較難實(shí)現(xiàn)，分子診斷自動(dòng)化系統(tǒng)便應(yīng)運(yùn)而生。其以通量大，重復(fù)性好、、封閉體系防污染、可實(shí)現(xiàn)的溫控及復(fù)雜的預(yù)處理過(guò)程，對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地要求不苛刻等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。
二
分子診斷自動(dòng)化系統(tǒng)的基本組成
及其應(yīng)用現(xiàn)狀
1．分子診斷自動(dòng)化系統(tǒng)的基本組成：
依據(jù)功能分為3部分：樣本前處理系統(tǒng)、檢測(cè)處理系統(tǒng)和分析處理系統(tǒng)，各個(gè)子系統(tǒng)由相應(yīng)的軟件和硬件緊密結(jié)合而成。系統(tǒng)涉及的關(guān)鍵技術(shù)包括：樣本提取和處理技術(shù)、目的分子的獲取與放大技術(shù)、信號(hào)檢測(cè)技術(shù)和數(shù)據(jù)分析與人工智能輔助診斷技術(shù)。
分子診斷自動(dòng)化的發(fā)展程度與儀器實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)過(guò)程覆蓋的范圍密切相關(guān)，若將樣本前處理自動(dòng)化系統(tǒng)稱之為分子診斷自動(dòng)化的1.0時(shí)代，那么樣本提取檢測(cè)一體化系統(tǒng)可以稱之為分子診斷自動(dòng)化的2.0時(shí)代，樣本提取檢測(cè)分析一體化系統(tǒng)可以稱之為分子診斷自動(dòng)化的3.0時(shí)代，期望可以實(shí)現(xiàn)分析全過(guò)程的自動(dòng)化處理，此外還可以利用人工智能實(shí)現(xiàn)報(bào)告綜合分析自動(dòng)審核、輔助診斷、個(gè)體化診療方案及預(yù)后提示、自助進(jìn)行臨床大數(shù)據(jù)分析及疾病建模研究，我們姑且稱之為分子診斷自動(dòng)化的MAX時(shí)代。
2．核酸提取的應(yīng)用現(xiàn)狀：
分子診斷研究的靶樣本種類繁多，包括核酸、蛋白質(zhì)、外泌體、細(xì)胞、組織等，臨床分子診斷現(xiàn)階段的研究對(duì)象集中于核酸。核酸提取技術(shù)是其涉及的關(guān)鍵技術(shù)之一，除包括常規(guī)DNA、RNA提取外還包括：ctDNA、血液游離DNA(cell-free fetal DNA，cfDNA)、微小RNA(micro RNA，miRNA)等特殊靶樣本的提取。從樣品中提取核酸的方法有很多種，其中，磁珠分離法是目前應(yīng)用廣、運(yùn)用于自動(dòng)化處理系統(tǒng)中為成熟的一種方法[7]。
由于ctDNA、cfDNA在外周血中含量極低，因此對(duì)于提取、檢測(cè)技術(shù)有很高的要求。目前ctDNA、cfDNA的檢測(cè)主要包括分離富集和檢測(cè)。富集方法包括梯度密度離心法、過(guò)濾法和磁珠法(常用)，檢測(cè)方法包括免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)以及芯片技術(shù)。分離提取miRNA的主要方法有：差速離心法、超濾法和免疫親和層析法，各有優(yōu)缺點(diǎn)，采用多種方法聯(lián)合應(yīng)用分離提取miRNA，可提高產(chǎn)物純度，穩(wěn)定生物活性。
3．國(guó)內(nèi)外分子診斷自動(dòng)化系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀：
1980年世界上臺(tái)臨床自動(dòng)化樣本處理裝置的投入使用，標(biāo)志著臨床實(shí)驗(yàn)室正式步入自動(dòng)化時(shí)代。隨著時(shí)間的積累和技術(shù)的滲透，臨床分子診斷自動(dòng)化拉開(kāi)序幕。目前已面世且獲得CFDA及FDA認(rèn)證的各平臺(tái)中，樣本提取檢測(cè)一體化平臺(tái)僅有羅氏公司推出的cobas？ AmpliPrep/cobas？ TaqMan？ with Docking及cobas？ s201全自動(dòng)核酸血液篩查系統(tǒng)兩款產(chǎn)品，基本實(shí)現(xiàn)了"樣本進(jìn)、結(jié)果出"的效果，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)全程操作標(biāo)準(zhǔn)化、空間封閉，故可以做到低污染、率、高重復(fù)性，但平臺(tái)兼容性和可擴(kuò)展程度較低，檢測(cè)項(xiàng)目有限。
國(guó)內(nèi)分子診斷自動(dòng)化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)起步相對(duì)較晚，目前還沒(méi)有國(guó)內(nèi)公司推出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的樣本提取檢測(cè)一體化產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)分子診斷設(shè)備公司為尋求自身發(fā)展，但苦于資金和技術(shù)等方面的限制，大多選擇和國(guó)外技術(shù)公司合作，以期在國(guó)內(nèi)迅速占領(lǐng)市場(chǎng)。博奧生物等公司先后推出過(guò)自動(dòng)移液工作站、核酸提取儀、PCR儀等臨床分子診斷類產(chǎn)品，一定程度上*，但自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)或技術(shù)含量不高、功能單一、*低是不爭(zhēng)的事實(shí)，需要再接再厲。
三
分子診斷自動(dòng)化主要技術(shù)參數(shù)
絕大部分公司推出的分子診斷自動(dòng)化產(chǎn)品均主要集中于樣本前處理階段，就目前階段而言，無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家，分子診斷自動(dòng)化仍然處于1.0時(shí)代，故以下我們將集中闡述樣本前處理自動(dòng)化系統(tǒng)的技術(shù)特征。
樣本前處理系統(tǒng)依據(jù)其功能的豐富程度又包括自動(dòng)移液工作站和自動(dòng)核酸提取儀兩類平臺(tái)。自動(dòng)化移液工作站是一種全自動(dòng)、高精度移液系統(tǒng)。專門用于小體積的PCR/qPCR體系配置，能夠*替代手工，保證了配置實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增體系的正確性，精密度以及重復(fù)性，但是因?yàn)楣δ軉我唬R床及科研應(yīng)用有局限。自動(dòng)核酸提取儀是集成了自動(dòng)移液工作站和標(biāo)準(zhǔn)耗材，在儀器預(yù)設(shè)程序控制下進(jìn)行核酸分離的儀器，這一類自動(dòng)化系統(tǒng)在科研和臨床中應(yīng)用為廣泛。
四
分子診斷自動(dòng)化的展望
1．人工智能：
近十年興起的微陣列芯片和二代測(cè)序等代表性技術(shù)，已經(jīng)成為一種重要的分子診斷工具，為這些代表性技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展提供強(qiáng)大支撐的學(xué)科就是人工智能。人工智能對(duì)分子診斷領(lǐng)域發(fā)展的具體影響已經(jīng)或?qū)?huì)體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)快速篩選相關(guān)疾病更加有效的診斷靶點(diǎn)；(2)使分子診斷結(jié)果更加、快速、準(zhǔn)確和可視化；(3)優(yōu)化計(jì)算方法，提高測(cè)試重復(fù)性和精密度；(4)大數(shù)據(jù)與分子診斷預(yù)測(cè)；(5)模型重建與結(jié)果的深度解讀和挖掘等[8]。
2．POCT：
分子診斷自動(dòng)化行業(yè)呈現(xiàn)出"戰(zhàn)國(guó)爭(zhēng)霸"的局面，但POCT的分子診斷繼承了自動(dòng)化系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，解決體積大、流程繁雜的缺點(diǎn)，(1)個(gè)體化、快速化、樣本少量化、裝備一體化、床旁化、設(shè)備小型化、手機(jī)化、app軟件化特點(diǎn)的POCT式分子診斷是大勢(shì)所趨；(2)芯片技術(shù)在POCT上的應(yīng)用使POCT式的分子診斷臨床*性突出，領(lǐng)域越來(lái)越寬；(3)國(guó)家政策支持：科技部、衛(wèi)生部制定的專項(xiàng)規(guī)劃中均明確提出"積極發(fā)展現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)儀器(POCT)等新產(chǎn)品"；(4)POCT市場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大且保持30%的高速增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到2020年產(chǎn)業(yè)規(guī)模可達(dá)1200億元，將進(jìn)一步催化POCT與分子診斷的整合。
3．醫(yī)療：
談醫(yī)療離不開(kāi)診斷，分子診斷是實(shí)現(xiàn)診斷的重要方法和途徑。醫(yī)療為分子診斷及分子診斷自動(dòng)化帶來(lái)的機(jī)遇主要體現(xiàn)在以下方面：(1)我國(guó)醫(yī)學(xué)研究計(jì)劃的實(shí)施為該領(lǐng)域配套研究提供了政策支持；(2)分子診斷自動(dòng)化是一個(gè)涉及多專業(yè)多行業(yè)的復(fù)合型應(yīng)用平臺(tái)，巨額資金的投入為相關(guān)學(xué)科和技術(shù)的快速發(fā)展提供了有力保障。
4．行業(yè)技術(shù)水平：
技術(shù)層面的發(fā)展將呈現(xiàn)出"統(tǒng)一化""集成化""微型化"的態(tài)勢(shì)。"統(tǒng)一化"指的是從行業(yè)層面制定規(guī)范、統(tǒng)一、適宜的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。CLSI已經(jīng)開(kāi)始致力于制定分子診斷自動(dòng)化設(shè)備的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。"集成化"和"微型化"是利用微電子、微流控等新興技術(shù)達(dá)到使系統(tǒng)空間上縮小集成，功能上放大可擴(kuò)展的效果，多學(xué)科交叉、高含金量技術(shù)疊加是必然趨勢(shì)[9]。
5．行業(yè)管理水平：
管理層面所面臨的問(wèn)題主要在于管理體系的制定、完善和實(shí)施，完善體系，分子診斷蓄勢(shì)待發(fā)。隨著國(guó)家政策的不斷完善、衛(wèi)生監(jiān)督部門對(duì)分子診斷重要性認(rèn)識(shí)的不斷深入，管理水平的提升也會(huì)使分子診斷自動(dòng)化在未來(lái)出現(xiàn)革命性的進(jìn)步。當(dāng)前發(fā)展階段解決問(wèn)題的關(guān)鍵是在規(guī)范各項(xiàng)規(guī)章制度的前提下，建立國(guó)家和區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)化分子診斷實(shí)驗(yàn)室和標(biāo)準(zhǔn)化自動(dòng)化操作程序(包括分析前、分析中、分析后)，盡早制定出一個(gè)符合中國(guó)國(guó)情的分子診斷自動(dòng)化監(jiān)管體系[10，11]，使我國(guó)分子診斷事業(yè)朝著健康有序的方向發(fā)展，更好地為臨床患者提供高質(zhì)量的分子檢測(cè)服務(wù)。(生物谷）
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