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| 導讀 | 2017年是CAR-T療法的元年，我們見證了兩款CAR-T療法的上市。日前，《科學》雜志推出了新興的癌癥免疫療法的特刊，回顧這些領域所取得的成就。在今天的文章中，我們一起了解風頭正盛的CAR-T細胞療法。 |
本文轉(zhuǎn)載自“藥明康德”。
CAR-T細胞療法屬于過繼性T細胞轉(zhuǎn)移（adoptive T-cell transfer，ACT）的一種，這是輸血醫(yī)學的一個新領域，涉及淋巴細胞回輸以實現(xiàn)抗腫瘤，抗病毒或抗炎作用。該領域從臨床前研究到臨床應用一直得到快速發(fā)展，去年我們見證了兩款CAR-T細胞療法的上市，用來治療白血病和淋巴瘤。作為*款上市的CAR-T細胞產(chǎn)品Kymriah的主要研發(fā)人員，賓夕法尼亞大學的Carl June教授等人在的《科學》綜述中，描述了目前CAR-T療法要進入主流腫瘤學領域面臨的機遇和挑戰(zhàn)。
▲賓夕法尼亞大學Carl H June博士（圖片來源：賓夕法尼亞大學）
1、TCR-T和CAR-T
目前，ACT癌癥療法主要有三種類型：腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、T細胞受體（TCR）T細胞和嵌合抗原受體（CAR）T細胞。TCR-T或CAR-T細胞是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)改造外周血T淋巴細胞而生成，CAR-T已經(jīng)有產(chǎn)品獲得FDA批準。TIL治療的原理在多個臨床試驗中得以證實，顯示出誘導轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的持久*反應，其能夠靶向黑色素瘤中的新抗原。針對這些不同形式的ACT，很多制藥和生物技術(shù)公司正在進行研發(fā)和商業(yè)化。
TCR由在T細胞表面與CD3復合物非共價結(jié)合的a-和β-鏈組成。*種進入臨床的TCR-T細胞癌癥免疫療法針對的適應癥是轉(zhuǎn)移性黑素瘤，使用TCR結(jié)合來自黑素細胞分化抗原的人淋巴細胞抗原A2(HLA-A2)肽。
隨后，更高親和力的TCR被開發(fā)出來，針對MART-1表位，通過降低MART-1表達來增強對癌細胞的識別。雖然這樣獲得了更高的緩解率，但會靶向表達在皮膚，眼睛和耳蝸的正常黑色素細胞。臨床中超過一半的患者出現(xiàn)脫靶效應（on-target/off-tumor）毒性，提示靶向共同抗原會使得有效性和毒性之間往往只是差之毫厘。另外，靶向腫瘤睪丸抗原MAGE-A3的TCRs產(chǎn)生致死性神經(jīng)毒性和心臟毒性，也對TCR的研發(fā)帶來新的挑戰(zhàn)。
然而，用表達對HLA-A2限制性肽特異性的TCR-T細胞靶向腫瘤睪丸抗原NY-ESO-1，獲得臨床有效的證據(jù)，而且沒有顯著的毒性。目前，工程化的NY-ESO-1 T細胞正在進行晚期臨床試驗 (NCT01343043)，或許針對特定腫瘤新抗原的TCR會比靶向腫瘤共有抗原更安全。這一點還需要臨床試驗進一步證實。
▲TCR-T和CAR-T細胞比較（圖片來源：《科學》）
相比之下，CAR結(jié)合了抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（zui常見的是由抗體可變結(jié)構(gòu)域衍生的單鏈可變片段（scFv）），TCRç鏈的信號結(jié)構(gòu)域，以及受體（如CD28，OX40和CD137）的共刺激結(jié)構(gòu)域。CAR克服了工程化TCR的某些局限性，例如需要MHC表達，MHC特性和共刺激信號。由Kuwana和Eshhar領導的小組表明了，這些類型的合成受體分子能夠使T細胞識別MHC非依賴性靶標。與MHC限制無關的CAR識別，使CAR-T細胞具有顯著的抗腫瘤優(yōu)勢，因為腫瘤免疫逃逸的主要機制之一就是腫瘤細胞MHC相關抗原提呈的丟失。目前CAR-T細胞的一個局限性是它們需要靶向腫瘤細胞表面上的抗原。
▲TCR-T和CAR-T細胞的構(gòu)成（圖片來源：《科學》）
2、在B細胞血液癌癥上大獲成功
事實上，使用*代CAR-T細胞療法治療多種癌癥的臨床試驗結(jié)果不盡如人意。直到2011年，靶向CD19和編碼共刺激區(qū)的第二代CAR-T細胞才成為癌癥工程化T細胞治療的主要范式。CD19的幾個主要的特征使它成為了近乎理想的治療靶點：在B細胞癌癥中高表達，是人類正常B細胞發(fā)育所必需，而且不在B細胞譜系之外表達。
大多數(shù)復發(fā)性白血病患者在CD19特異性CAR-T細胞治療后獲得*緩解。但出現(xiàn)了兩種形式的抗性。在急性白血病患者中，CD19抗原表位的缺失是腫瘤逃逸的主要機制。在針對青少年和小兒急性白血病患者的臨床試驗中，CD19表達陰性的患者復發(fā)率為28％。在慢性淋巴性白血病(CLL)中，尚無報道發(fā)現(xiàn)CD19缺失產(chǎn)生耐藥，CLL的耐藥性可能是由于細胞輸注后CAR-T細胞不能增殖。表2列出了CAR-T細胞療法在臨床治療中需要克服的幾個重要挑戰(zhàn)。
▲CAR-T細胞療法面臨的臨床挑戰(zhàn)和解決策略（圖片來源：《科學》）
3、超越B細胞
目前，CAR-T技術(shù)已被證明除了靶向CD19之外還有更廣泛的應用，針對靶點BCMA和CD22的CAR-T細胞在治療多發(fā)性骨髓瘤和急性淋巴性白血病的早期臨床試驗中顯示出抗腫瘤療效。然而，BCMA和CD22與CD19一樣，高度局限于在B細胞系上表達，因此只對特定組織有效。靶向?qū)嶓w瘤相關的抗原方面仍然沒有太多進展。
ERBB2/HER2是腫瘤中過度表達的一種酪氨酸激酶受體，是許多抗體和ADC藥物的有效靶標。但是，靶向ERBB2/HER2的CAR-T細胞治療*例患者時產(chǎn)生了致命的毒性。跟多研究發(fā)現(xiàn)毒性是由于低密度表達ERBB2的肺上皮細胞也被CAR-T細胞識別和攻擊，引發(fā)肺功能衰竭和大量細胞因子釋放。因此，研究者采用更低劑量、更低親和力的CAR- T細胞治療肉瘤患者，結(jié)果顯示是安全的，但臨床效果有限。
另外，以碳酸酐酶IX(CAIX)抗原作為靶點的一代CAR-T細胞療法在治療腎細胞癌的1期臨床試驗中也意外產(chǎn)生肝毒性，原因是CAIX抗原在正常膽道上皮細胞也有低密度表達，但這在臨床前研究中沒有發(fā)現(xiàn)。以CEACAM5作為靶點的CAR-T細胞療法在臨床試驗中，出現(xiàn)延遲的呼吸毒性，且與T細胞峰值擴展一致，表明癌癥相關抗原潛在的on-target/off-tumor毒性。
靶向與實體瘤相關的其他共有抗原，如間皮素、癌胚抗原和GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的CAR-T療法在臨床試驗中未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性；然而，這些試驗中觀察到的抗腫瘤活性也很弱。而具有增強的抗腫瘤活性的GD2特異性CAR-T細胞已經(jīng)在臨床前模型中發(fā)現(xiàn)會誘導致命的神經(jīng)毒性。
另外，腫瘤微環(huán)境是ACT療法成功應用的一大障礙，特別是在實體瘤中。包括免疫檢查點(如PD-L1表達)、腫瘤代謝環(huán)境的改變(如缺氧或吲哚胺-1-氧化酶和精氨酸酶)、調(diào)節(jié)性T細胞以及抑制性骨髓細胞。在細胞治療的過程中，這些免疫和代謝檢查點在腫瘤中的表達都會升高，表現(xiàn)出適應性耐藥。
目前，PD-1/PD-L1單抗與CD19 CAR-T細胞療法組合的臨床試驗正在進行中(例如NCT02926833，NCT02650999和NCT02706405)。除了與檢查點抑制劑的組合以外，研究人員還在研發(fā)阻斷這些抑制通路的替代療法，例如開關受體或基因編輯。
4、CAR-T療法的毒性
接受ACT治療后，T細胞活化會產(chǎn)生免疫刺激和炎癥反應。目前，靶向CD19、BCMA和CD22的CAR-T細胞療法都出現(xiàn)過嚴重的細胞因子釋放綜合征(CRS)，比用TIL和TCR治療出現(xiàn)的流感樣綜合征更加嚴重。CAR-T細胞療法帶來的CRS與腫瘤負荷相關。
此外，靶向CD19和BCMA的CAR-T細胞曾報道過意外神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。其中CD19 CAR-T細胞療法產(chǎn)生的神經(jīng)毒性大部分可逆，但目前還不清楚腦水腫是CRS引起的還是另外有作用機制。目前，研究人員對于T細胞免疫療法導致的CRS和腦水腫的機制仍不清楚。
▲CAR-T細胞療法的副作用：細胞因子釋放綜合癥和神經(jīng)毒性（圖片來源：《科學》）
5、通用型CAR-T療法
盡管ACT療法屬于異基因骨髓移植，但由于MHC的原因，ACT療法目前仍集中在自體T細胞。如果可以消除MHC障礙，就能夠?qū)崿F(xiàn)同種異體T細胞治療。與自體T細胞療法相比，通用型CAR-T細胞來源于健康供體，有可能克服許多與癌癥治療相關的免疫缺陷；另外，通用型CAR-T細胞療法的制造工藝更加簡化，有望實現(xiàn)更快速、更便宜的“現(xiàn)成(off the shelf)”細胞療法產(chǎn)品。
zui近，一項采用TALEN（轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶）基因工程化改造的細胞在兩名患者身上進行了試驗，結(jié)果證明了現(xiàn)成的CD19 CAR-T細胞療法的可行性。但基因通用型CAR-T細胞的移植在兩個受試者中都受到限制，減弱了療法的有效性。重要的是，受試者1的所有MHC I等位基因發(fā)生錯配，導致了移植物抗宿主病。這意味著*的基因編輯對于該療法的成功至關重要。另外，自然殺傷(NK)細胞對MHC I類缺陷細胞的識別也可能限制了移植。防止NK細胞溶解通用型CAR-T細胞的一種方法是插入HLA-E并刪除HLA-A，-B和-C，這樣可以阻止宿主T細胞殺死通用型CAR-T細胞。
由于該領域的快速發(fā)展，通用型CAR-T細胞可能得到廣泛應用。然而，問題是它到底能作為單藥療法還是（例如干細胞移植或自體CAR-T細胞治療的）輔助療法。
6、基因編輯和多功能CARs
有許多基因編輯工具，包括鋅指核酸酶（ZFNs），歸巢核酸內(nèi)切酶（meganucleases），TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶。這些技術(shù)已經(jīng)成功應用于工程化T細胞研究。現(xiàn)在該領域的主要問題是源自細菌的Cas9的免疫原性是否會影響CRISPR-Cas9基因編輯的T細胞的藥物輸送。
基因組編輯有可能用來解除CTLA-4和PD-1等免疫抑制信號，增強T細胞的功能，同時避免全面阻斷免疫檢查點分子帶來的相關毒性。基因編輯也可以用于敲除T細胞表達的CAR靶點的基因，使得靶向不適用于T細胞免疫療法的抗原成為可能。zui近，研究者將CAR引入TCR基因座，可以在內(nèi)源性TCR啟動子的條件下控制受體表達，從而顯著增強CAR-T細胞功能。
為了減少與ACT的自身反應性免疫的潛在風險，研究人員已經(jīng)開發(fā)了使基因工程T細胞誘導性死亡的合成分子系統(tǒng)，通常稱為“自sha開關”。zui有名的方法是用促凋亡蛋白caspase-9與FKBP12（iCasp9）的結(jié)構(gòu)域融合。在引入二聚體小分子例如利米德凝膠時，iCasp9的FKBP12結(jié)構(gòu)域二聚化，使得T細胞經(jīng)歷快速凋亡性細胞死亡。在造血干細胞移植后的同種異體淋巴細胞輸注中評估了iCasp9方法的試驗，已經(jīng)證實了強大T細胞消除能力，避免移植物抗宿主病。
7、CAR-T的推廣之路
目前，有250多個關于CAR-T細胞的臨床試驗研究。其中，中國和美國是兩大熱門地區(qū)，歐洲、日本和南半球的臨床試驗數(shù)量要少得多。這與接受和投資新興療法的意愿，衛(wèi)生監(jiān)管政策以及社會差異都相關。
▲CAR-T細胞療法臨床試驗的分布（圖片來源：《科學》）
血液癌癥患者，特別是CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者接受有效、但不能治愈的療法帶來的經(jīng)濟負擔也是一大挑戰(zhàn)。CLL是美國zui常見的白血病形式，2000年約有100,000名患者，而且目前的療法都只能改善生存狀況，并不能治愈。因此給患者帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。據(jù)估計，每名患者的終生治療費用為604,000美元，到2025年，美國的CLL的醫(yī)療費用估計超過50億美元/每年。
CAR-T細胞治療可能比現(xiàn)有的標準療法更具成本效益。目前高度個體化的T細胞療法的工藝需要定制，由此帶來高成本。但隨著工藝的成熟，制造成本會有所下降。
8、未來機會與挑戰(zhàn)
治療白血病和淋巴瘤的CAR-T細胞療法的出現(xiàn)值得關注，有多個方面的原因。也許zui重要的原因是，CAR-T是經(jīng)美國FDA批準的*種獲得推廣的基因療法。
目前，開發(fā)細胞療法的zui大挑戰(zhàn)之一是缺乏可以評估這些復雜療法的安全性和有效性的臨床前模型，或者是對早期臨床研究中發(fā)現(xiàn)的安全問題的應對措施。另外，在治療實體瘤方面仍然存在許多障礙。
值得期待的是，由于工程化T細胞、基因編輯和細胞制造領域的技術(shù)進步，未來基于T細胞的療法有望擴大到其他細胞類型，如誘導多能干細胞、造血干細胞和NK細胞；適應癥也會超越癌癥，有望用于傳染性疾病、器官yi植和自身免疫性疾病等各類疾病。
參考資料：
[1] CAR T cell immunotherapy for human cancer
13916499749
