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| 導(dǎo)讀 | 小鼠常被用于研究癌癥，但科學(xué)家仍在努力改善這一模型，以更好地研究人類疾病。基因編輯的進步使研究人員能夠構(gòu)建更能反映人類疾病的小鼠模型。 |
本文轉(zhuǎn)載自“生命奧秘”。
1915年，處于戰(zhàn)爭狀態(tài)，日本病理學(xué)家Katsusaburo Yamagiwa和他的助理Koichi Ichikawa正在努力研究一個致命武器，其殺傷力堪比西線戰(zhàn)場的戰(zhàn)爭。這個來自東京大學(xué)（Imperial University）的二人組花了150多天把煤焦油涂在兔子的耳朵上。zui后，他們發(fā)現(xiàn)兔子罹患了腫瘤。
Yamagiwa的兔子模型被認為是*個用于癌癥研究的動物模型。自此，科學(xué)家使用了包括細胞系、基因工程小鼠在內(nèi)的多個模型來模擬人類癌癥。但為解答特定實驗問題而選擇模型時需要考慮多個因素。
據(jù)馬薩諸塞州波士頓丹娜法伯癌癥研究院（Dana-Farber Cancer Institute）的醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)家David Weinstock表示，什么樣的模型是一個好的癌癥模型“是一個非常復(fù)雜的問題，zui簡單的答案是它必須能夠給我啟發(fā)——真正回答我想問的問題。如果不能，那就是在浪費我的時間”。
對于美國國家癌癥研究所（US National Cancer Institute, NCI）的部門負責人Nancy Boudreau來說，模型與人類癌癥的相似度至關(guān)重要。她表示，模型越能體現(xiàn)人類疾病的發(fā)生和發(fā)展就越好。理想的癌癥模型應(yīng)該能夠反映人類癌癥發(fā)生的許多特征，包括如何應(yīng)對免疫系統(tǒng)、如何轉(zhuǎn)移，或從其主要來源擴散到身體的其它部位，以及如何對治療產(chǎn)生響應(yīng)。這需要科學(xué)家了解每種癌癥模型的優(yōu)缺點，因為沒有哪個模型能夠解答所有問題。
一些證據(jù)表明，盡管有很多選擇，但現(xiàn)有的癌癥模型還不足以開發(fā)療法。生物技術(shù)創(chuàng)新組織（Biotechnology Innovation Organization）審查了從2006年至2015年的臨床試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在針對15種疾病組別的臨床試驗中，癌癥藥物的失敗率zui高，在通過臨床1期的癌癥藥物中，zui終獲得批準的比例僅為5.1%。相比之下，血液學(xué)和傳染病藥物的臨床試驗成功率分別為26.1％和19.1％。
德國癌癥研究中心（German Cancer Research Center）的血管腫瘤專家Hellmut Augustin指出，如果更好的臨床前模型可以將臨床轉(zhuǎn)化率提高10％，這將極大地提高臨床前癌癥研究的質(zhì)量，并為藥物節(jié)省巨大開支。
研究人員一直為改進現(xiàn)有模型做出了諸多努力。他們在范圍內(nèi)展開合作，希望改善這些模型。例如，NCI、英國癌癥研究所（Cancer Research UK）、英國維康信托桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）和荷蘭烏得勒支的非營利性組織Hubrecht Organoid技術(shù)公司聯(lián)手開展了一項名為人類癌癥模型倡議（Human Cancer Models Initiative）的計劃。該倡議于2016年啟動，目標是在細胞系中開發(fā)1000種新型癌癥模型，以供研究人員使用。這些項目表明，許多科學(xué)家都認同擴大癌癥模型庫的價值。
修飾小鼠基因組
一般情況下，細胞株都可以幫助我們解決很多研究難題。但這些細胞通常以2D形式生長，缺乏人類癌癥生長，尤其是免疫系統(tǒng)生長的正常條件。這使培養(yǎng)的細胞不適合模擬癌癥的多個特征。NCI的癌癥系統(tǒng)生物學(xué)家Shannon Hughes指出，相比之下，基因工程小鼠（genetically engineered mouse, GEM）適用于多個研究。它們能更好地模擬人類癌癥特征，并且容易操控。
多年來，基因工程小鼠需要復(fù)雜的過程來產(chǎn)生所需的DNA，在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化細胞，然后將其注入到小鼠胚胎，以修飾小鼠的基因。但是，與大多數(shù)其它遺傳修飾應(yīng)用一樣，現(xiàn)在制作GEM的方法隨著CRISPR基因編輯系統(tǒng)的問世而獲得改進。紐約威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院（Weill Cornell Medical College）的癌癥生物學(xué)家Lukas Dow表示，CRISPR可以完成一些非常精細的、以前無法完成的操作。例如現(xiàn)在誘導(dǎo)大型染色體重組，如反轉(zhuǎn)、缺失和易位的技術(shù)已經(jīng)比較簡單直接了。但有了CRISPR后，科學(xué)家甚至可以改變嚙齒動物的DNA中的一個堿基。他指出，這種技術(shù)還可以清晰到讓每個堿基的分辨率準確再現(xiàn)科學(xué)家在人類癌癥中觀察到的突變。以前的癌癥模型都忽略了這些細節(jié)，但是病因往往就在這些細節(jié)里。
韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究所（South Korea’s Institute for Basic Science）的基因組工程師Taeyoung Koo等人使用CRISPR靶向一個非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）突變。他們報告指出，15％的人類NSCLC病例涉及表皮生長因子受體（epidermal growth-factor receptor, EGFR）基因中僅一個DNA堿基的改變（即單核苷酸突變）。目前治療方案主要是使用靶向該基因的突變蛋白的藥物，例如gefitinib。
Koo的團隊開發(fā)了CRISPR-Cas9向?qū)NA序列，該序列識別zui常見的EGFR突變區(qū)域（這種突變占EGFR突變相關(guān)NSCLC病例的40％以上）。然后他們將人類NSCLC腫瘤植入小鼠，并用CRISPR-Cas9和特定的向?qū)NA靶向突變。結(jié)果顯示，設(shè)計合理的向?qū)NA能準確地打斷致病序列，產(chǎn)生治療效果。他們報告稱，Cas9酶可以有效區(qū)分EGFR突變型等位基因與野生型等位基因，從而破壞致癌基因，誘發(fā)癌細胞死亡。
Dow提醒，雖然CRISPR具有顯著的靶特異性，但其切割結(jié)果高度多變。因此，如果目標是在所有病例中都產(chǎn)生一致的遺傳變化，那么Cas9之類的核酸酶就不是一個好選擇了。傳統(tǒng)CRISPR系統(tǒng)中DNA修復(fù)的隨機性意味著，你需要面對細胞異質(zhì)性的問題。
一個乳腺癌細胞在顯微鏡下遷移。
GEM有其局限性，特別是在疾病的發(fā)展時間和異質(zhì)性方面。據(jù)Hughes解釋，小鼠腫瘤發(fā)展非常快，從而迫使研究人員加快他們的實驗進度，但這與人類疾病的發(fā)展速度大不相同。此外，小鼠腫瘤往往過于同質(zhì)，而無法正確反映人類疾病：GEM通常只包含一兩個基因改變，而人類腫瘤通常有很多基因改變。
為了解決缺乏異質(zhì)性的問題，并產(chǎn)生更忠實于人類癌癥的模型，德州大學(xué)安德森癌癥中心（University of Texas MD Anderson Cancer Center）的生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家Lorenzo Federico等人在系統(tǒng)生物學(xué)家Gordon Mills的實驗室里展開研究，設(shè)計了一系列來自轉(zhuǎn)基因小鼠原發(fā)乳腺腫瘤的可移植細胞系。zui后他們得到了12個新的小鼠移植細胞系——可以可靠地產(chǎn)生具有一系列突變的特定類型的腫瘤小鼠模型。Federico表示，理想的情況是，不同小鼠發(fā)生的不同原發(fā)性腫瘤應(yīng)具有不同的分子改變，以更忠實地反映人類癌癥的遺傳特征。
這些模型已被用于靶向治療（包括癌癥分子途徑抑制劑）的臨床前評估。根據(jù)Federico的說法，這些模型也非常適合研究免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生和治療發(fā)展中的作用。然而，他指出，由于這些移植物來源于基因工程小鼠腫瘤，對于得到的結(jié)果，“我們需要保持謹慎”。
癌癥如何發(fā)生和發(fā)展，取決于它與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用。其中一些zui有希望的治療方法是免疫療法，它通過激活患者的免疫系統(tǒng)來攻擊特定的腫瘤。為了研究這些療法，科學(xué)家需要具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠——是具有人類的免疫系統(tǒng)。這就需要人源化的小鼠模型。
為了讓GEM擁有人的免疫系統(tǒng)，科學(xué)家要將人造血干細胞（多種血細胞的前體細胞）植入免疫缺陷的小鼠體內(nèi)。這一過程重現(xiàn)了人體免疫系統(tǒng)的某些方面，例如負責攻擊外來細胞的白血球。然后，研究人員便可以將人類腫瘤樣本（病人源性腫瘤異種移植物，patient-derived xenograft, PDX）移植到小鼠體內(nèi)，創(chuàng)建更真實的人類疾病模型。
根據(jù)Augustin的說法，PDX模型越來越受到藥物的歡迎。藥物開發(fā)商將PDX用作藥物測試的試驗基地。PDX模型也開始進入基礎(chǔ)研究實驗室，并且可以在市場上購買到。緬因州巴爾港的杰克遜實驗室（Jackson Laboratory）與超過20家癌癥診所合作，創(chuàng)建了450多種這類小鼠模型，其中包括急性骨髓性白血病和膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。Jackson實驗室表示，這些小鼠的成本通常是標準免疫缺陷小鼠的三倍。
科學(xué)家也可以開發(fā)自己的PDX小鼠模型。圣裘德兒童研究醫(yī)院（St. Jude Children’s Research Hospital）的腫瘤學(xué)家Elizabeth Stewart等人使用手術(shù)切除的、能反映大腦、骨骼和其它癌癥的小兒實體瘤樣本，構(gòu)建了67個PDX小鼠模型，這覆蓋了十多種腫瘤類型。
Stewart等人的目標是創(chuàng)建模型來研究針對不同腫瘤類型的藥物的治療效果——這需要模型準確地代表原始疾病。Stewart的研究小組決定使用全基因組和全外顯子DNA測序技術(shù)，從核酸水平上比較PDX和原始腫瘤。他們發(fā)現(xiàn)，總體而言，PDX的DNA序列在很大程度上與原始腫瘤的基因組特征相匹配，但也出現(xiàn)了新的突變。據(jù)研究人員總結(jié)，PDX“保留了患者腫瘤的分子和細胞特征，以及其發(fā)育起源的表觀遺傳特征”。
這并不是說PDX是靜態(tài)的。哈佛-MIT博德研究所（Broad Institute of Harvard and MIT）的所長Todd Golub及其研究小組研究了代表24種癌癥的543個PDX模型中的拷貝數(shù)變異（copy-number variations, CNV）。他們發(fā)現(xiàn)， 原始小鼠1次傳代后，60％的PDX中插入了長達500萬個堿基的CNV基因擴增區(qū)域，4次傳代后這個概率是88％。結(jié)果顯示，zui初模仿人類疾病的PDX可以演變成不能模仿人類疾病的形式。當這種情況發(fā)生時，PDX便不能再模擬目標癌癥了。
Boudreau認為，將人類PDX模型組織移植到人源化小鼠中會得到zui有吸引力的一種新癌癥模型，但他表示這“尚未*實現(xiàn)”，因為研究人員尚未掌握技術(shù)的細節(jié)。據(jù)她補充，隨著科學(xué)家對免疫治療和腫瘤響應(yīng)的機制的興趣的增加，人源化小鼠將會變得非常重要。
回歸原始方法
一些科學(xué)家使用Yamagiwa的老方法，而不是基因技術(shù)來制造更實用的癌癥模型。這種化學(xué)致癌方法以普通的實驗室小鼠為研究對象，結(jié)果可以產(chǎn)生更真實的癌癥模型。
據(jù)加利福尼亞大學(xué)舊金山分校（University of California, San Francisco）的腫瘤生物學(xué)家Melissa Reeves解釋，用一種致癌物質(zhì)處理小鼠，就像一種環(huán)境因素會造成特定類型的損傷，并獲得特定類型的腫瘤，如皮膚腫瘤。這對于模擬由于重復(fù)暴露于特定環(huán)境的人類腫瘤很有幫助，因為它模擬了由廣泛基因損傷引起的腫瘤的自然演變。
化學(xué)致癌物質(zhì)可能會在數(shù)百個位點破壞DNA，并且隨著時間的推移影響會繼續(xù)存在。Reeves等人采用這種方法，在小鼠皮膚局部涂抹名為DMBA和TPA的已知致癌物，誘導(dǎo)小鼠發(fā)生皮膚癌，進而研究腫瘤如何從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移至繼發(fā)部位。她的研究結(jié)果表明，皮膚癌不會按順序從一個位置遷移到另一個位置——例如，從皮膚到淋巴結(jié)再到肺，而是“通過平行傳播，同時進入淋巴結(jié)和肺部”。
Reeves表示，這一成果證實了一個臨床發(fā)現(xiàn)：去除乳腺癌周圍的淋巴結(jié)并不總是能夠提高生存率，這一觀察結(jié)果促使研究人員推測平行傳播的可能性。
盡管與GEM和人源化小鼠相比，化學(xué)致癌作用可能可以產(chǎn)生更好的、類似于人類癌癥異質(zhì)性的腫瘤，但實際上這些模型也存在明顯的缺點。通過化學(xué)手段誘發(fā)原發(fā)性腫瘤，然后將其移除并研究轉(zhuǎn)移過程，可能需要18個月。Reeves指出，另外，每個腫瘤都會有所不同。
同樣，每種癌癥模型都不盡相同，小鼠模型并不總是的選擇，小鼠的飼養(yǎng)費用昂貴，并容易引起倫理問題，這讓細胞系不失為一種值得考慮的研究對象。
目前，研究人員只能選擇一種zui能解答他們問題的模型——盡管存在缺陷。同時，科學(xué)家將不斷改善現(xiàn)有模型，并開發(fā)新模型。正如Augustin指出的那樣，“用于開發(fā)和使用臨床轉(zhuǎn)化率更高的小鼠腫瘤模型的投資非常有意義。”否則，我們可能永遠無法提高臨床試驗中癌癥藥物的成功率。
小鼠并不是研究人員模擬癌癥的*選擇。一種流行的新興替代方法是類器官——模仿一些器官的微觀解剖，例如血管系統(tǒng)的3D細胞培養(yǎng)物。
法國奧爾良分子生物物理中心（Centre for Molecular Biophysics）的分子生物學(xué)家Claudine Kieda表示，腫瘤就像是一個多種組織合作的器官。3D細胞模型可充分考慮微環(huán)境，例如腫瘤周圍和內(nèi)部的氧氣水平。
Kieda的實驗室將黑素瘤和內(nèi)皮細胞結(jié)合在由膠原蛋白、生長因子和一個名為Matrigel的3D支架組成的基質(zhì)中。這種混合物允許細胞形成類似于腫瘤及其周圍環(huán)境，特別是在氧化方面的結(jié)構(gòu)。Kieda指出，每個細胞都在像孵化器那樣的環(huán)境中工作，氧氣的分壓遠遠高于體內(nèi)。”
此外，類器官對于藥物開發(fā)也很有價值。例如，英國劍橋大學(xué)（University of Cambridge）的組織修復(fù)生物學(xué)家Meritxell Huch等人創(chuàng)建了用于藥物篩選的肝癌類器官。這種類型的腫瘤只有20%的概率能在小鼠身上生長，但Huch實現(xiàn)了近80％的成功率——并且該過程的效率大約是PDX的兩倍。Huch表示，速度是主要優(yōu)勢。Huch的研究小組利用這些類器官，開發(fā)了一種信號通路抑制劑，以用于治療原發(fā)性肝癌。
與其它癌癥模型一樣，一個好的類器官要盡可能地忠實地重現(xiàn)人類疾病。美國國家癌癥研究所（US National Cancer Institute）的腫瘤轉(zhuǎn)移研究員Nancy Boudreau表示，類器官比細胞更具生物學(xué)特性，而且比小鼠便宜。
原文檢索：
Mike May. (2018) Cancer research with a human touch. Nature, 556: 259-261.
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